Doutoramento em Ciências Agrárias
Exploring alternative oxidase (AOX) as a functional marker candidate for efficient somatic embryogenesis in Daucus carota L.
António Frederico

Orientação:  Augusto António Vieira Peixe & Manuel Pedro Salema Fevereiro &  Elena Baena-González

A embriogénese somática é o mais conhecido exemplo de reprogramação celular.

Daucus carota L. foi a primeira espécie onde a totipotência foi comprovada, através da embriogénese somática. No entanto, mesmo em Daucus , considerada como modelo e facilmente induzível, existe uma influência genética na capacidade das células para serem reprogramadas. Neste sentido, a identificação de marcadores para a ‘fácil reprogramação’ pode ajudar ao desenvolvimento de marcadores funcionais para a eficiente propagação in vitro de genótipos recalcitrantes. Tendo como objetivo explorar esta questão e usando a oxidase alternativa como o gene candidato a marcador funcional, 28 genótipos de Daucus foram induzidos a realizar embriogénese somática indireta. Desses, 25 responderam ao processo, produzindo 139 linhas celulares. A eficiência embriogénica das linhas foi avaliada utilizando um método de fenotipagem em dois passos, concebido para a seleção dos fenótipos estáveis. Após o primeiro passo de fenotipagem, 41 linhas com eficiência embriogénica estável foram avaliadas e caracterizadas em relação à diversidade genética utilizando o método cTBP. Destas, 22 foram selecionados para o segundo passo de fenotipagem. Finalmente, 8 linhas celulares foram identificadas, como altamente estáveis para as eficiências embriogénicas extremas. Quatro eram muito eficientes ou muito eficientes / eficientes, e as restantes não-embriogénicas. Estas foram estabelecidas como a coleção base utilizada para uma avaliação mais aprofundada, tanto em relação à ploidia, como na investigação da oxidase alternativa. Foi detectada poliploidia em três das linhas celulares, independentemente da sua capacidade embriogénica. No entanto, considerando a mais recente informação, em que se refere a poliploidia como uma importante fonte de variabilidade para a tolerância ao stress geral, a sua utilização no presente estudo foi considerada. Os três genes da oxidase alternativa foram amplificados a partir da coleção base e explorados tendo em vista a identificação de posições polimórficas associadas com os fenótipos definidos. No total, 290 sequências foram amplificadas, das quais 47 foram identificadas como polimórficas. Destas, 11 foram identificadas como oxidase alternativa 1 , 22 como 2a e 14 como 2b , sendo que a maior variabilidade foi detetada no gene 2a . As análises filogenéticas realizadas, não permitiram a identificação de qualquer grupo de sequências associado a qualquer um dos fenótipos em estudo. No entanto, a procura por elementos de regulação realizada nas zonas codificantes em cada um dos genes, detetou três elementos nas sequências do gene 2b , que estavam associados maioritariamente a linhas embriogénicas. De igual forma, também os resultados do intrão 1 no gene 2b obtidos a partir do IMeter, apontam este como possível regulador das atividades do gene nessas linhas. Embora limitadas, tais observações apontam para o 2b , como sendo o gene envolvido na capacidade das células de Daucus para desenvolver embriões. No entanto, e dadas as limitações, tal indicação requer uma investigação mais aprofundada.

Palavras-Chave:  Daucus; Embriogénese somática; Linha celular; Oxidase alternativa; Local polimórfico